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アンプリコンシーケンス

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アンプリコンシーケンスアンプリコンシーケンスは、微生物種の同定に頻繁に用いられます。保存遺伝子または遺伝子間の短い超可変領域(<500 bp)は、PCR で増幅後に次世代シーケンステクノロジーを用いて解析されますが、 生成されたシーケンスは微生物データベースに対して比較されます。

細菌や古細菌では、16S rRNA 遺伝子が、アンプリコンシーケンスで最も利用されるターゲットです。真菌では、18S rRNA 遺伝子および rRNA 遺伝子間に存在する 2 つの内部転写スペーサー領域(ITS)といった 3 つのターゲットが一般的に用いられます。これらの領域は通常、かなりの近縁種を分類するのに十分な特異性を持ち合わせているため、亜種を区別することもあります。

Novogene では、170,000 以上の微生物検体をシーケンスした実績があります。Novogene の標準バイオインフォマティクス解析では、アルファ多様性(α-diversity)解析、OTU 解析、アノテーション解析、β 多様性(β-diversity)解析、多変量解析が挙げられます。用途は、純粋培養で単一種を同定することから、様々な環境要因または地理的領域で種多様性と集団構造を比較することで動物または植物の微生物叢を特徴づけることまでへと多岐にわたります。Novogene の専門家は、お客様のプロジェクトに適切な解析をアドバイスできます。

Novogene の強み

  • 非常に経験豊富: 170,000 件以上の検体のシーケンスを行い、その結果 30 本近い論文を発表しました。
  • 優れたサービス: Novogene は、高品質のシーケンス、効率的な標準的ワークフロー、迅速な納期とバイオインフォマティクス解析を費用対効果に優れた価格で提供しています。
  • 効果的な方法: Novogene の方法は、検体 DNAの増幅が高効率で得られること(>95%)が特徴で、増幅DNAのバイアスを回避するために、PCR フリーライブラリを使用しています。
  • 総合的な解析: 最新のシーケンスデータベースとソフトウェアを使用して専門家のバイオインフォマティクス解析を提供することで、高品質ですぐに公表できるデータを生成することができます。

プロジェクトのワークフロー

アンプリコンシーケンスと 16s rRNA シーケンスのワークフロー

シーケンス条件

  • インサートサイズが130-470 bpのDNAライブラリ
  • HiSeq プラットフォーム、250 bpペアエンドリード
ターゲット領域断片長プライマープライマーシーケンス(5’- 3’)
細菌
16S rDNA
V4292 bp515FGTGCCAGCMGCCGCGGTAA
806RGGACTACHVGGGTWTCTAAT
V3-V4466 bp341FCCTAYGGGRBGCASCAG
806RGGACTACNNGGGTATCTAAT
V4-V5393 bp515FGTGCCAGCMGCCGCGGTAA
907RCCGTCAATTCCTTTGAGTTT
古細菌
16S rDNA
V4397 bp519FCAGCCGCCGCGGTAA
915RGTGCTCCCCCGCCAATTCCT
288 bpU519FCAGYMGCCRCGGKAAHACC
806RGGACTACNSGGGTMTCTAAT
真菌
18S rDNA
V4179 bp528FGCGGTAATTCCAGCTCCAA
706RAATCCRAGAATTTCACCTCT
V9131 bp1380FCCCTGCCHTTTGTACACAC
1510RCCTTCYGCAGGTTCACCTAC
真菌
ITS*
ITS1307 bpITS5-1737FGGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG
ITS2-2043RGCTGCGTTCTTCATCGATGC
ITS2386 bpITS3GCATCGATGAAGAACGCAGC
ITS4TCCTCCGCTTATTGATATGC
* ITS1 は、18S と 5.8S rRNA 遺伝子の間にあり、ITS2 は、5.8S と 28S rRNA遺伝子の間にあります。

データ品質保証

  • 各検体のデータ量は、少なくとも 30,000 tags、50,000 tags あるいは 100,000 tags あります。

サンプル条件

  • DNA 量:≥ 150 ng (1 つのライブラリ調製用*)
    *複数の DNA 検体を混合することで、ライブラリを 1 つ調製することができます。
  • PCR 産物:≥ 400 ng(1 つのライブラリ調製用)
  • DNA 濃度:≥ 20 ng/μl
  • 純度:OD260/280 = 1.8 - 2.0 (分解またはコンタミがないこと)
  • 増幅された領域は、470 bp 未満である必要があります。

納期

  • 検体の質を確認後 15  営業日以内(データ解析なし)
  • データ解析にはさらに 11 営業日

推奨されるシーケンス深度

  • 3 つの戦略:30,000 tags、50,000 tags または 100,000 tags

解析パイプライン

アンプリコンシーケンスと 16s シーケンスの解析パイプライン

解析の一覧

  • データの品質管理
  • OTU(操作的分類単位)のクラスタリングとフィルタリング
  • 希薄化曲線、Chao-1 曲線、シャノン曲線、相対優占度曲線、と α インデックステーブルなどの α 多様性解析
  • Krona 結果、系統発生的組成解析、系統発生樹、ヒートマップ、系統樹などの OTU 解析とアノテーション解析
  • 非加重 UniFrac 距離ヒートマップ、PCA(主成分解析)、PCoA(元座標解析)、UPGMA(非加重結合法非加重結合法)、NMDS(非計量多次元尺度法)解析などのβ-多様性解析
  • LEfSe(LDA 効果量)解析、メタ統計解析、ANOSIM、MRPP 解析などの多変量解析
以下の検査は、Novogene のアンプリコンシーケンスサービスを利用しました。

Microbiota modulate tumoral immune surveillance in lung through a T17 immune cell-dependent mechanism
Cancer Research, 74:4030 (2014)

共生細菌が免疫ホメオスタシスに及ぼす影響に関する本研究では、治療群と無治療群のマウスから得た便検体を用いて、抗生物質療法後の共生細菌の変化を監視する際に Novogene のテクノロジーが用いられました。イルミナ MiSeq プラットフォームを用いた 16S rDNA 解析では、複数の分類群が存在したこと、またそれらの相対豊富度が抗生物質療法によって変化したことを示しました。

 

アンプリコンチャート

図。様々な抗菌薬療法後の微生物叢の変動

Novogene のサービスを使用した出版物の一例

会誌
Cancer Research, 74:4030-4041 (2014)Microbiota modulate tumoral immune surveillance in lung through a γδT17 immune cell-dependent mechanism.
Environmental science & technology, 49:7152-7160 (2015)Community structure and soil pH determine chemoautotrophic carbon dioxide fixation in drained paddy soils.
Chemical Engineering Journal, 285:319-330 (2016)Microbial diversity in combined UAF–UBAF system with novel sludge and coal cinder ceramic fillers for tetracycline wastewater treatment.
Environment international, 92:1-10 (2016)Long-term field application of sewage sludge increases the abundance of antibiotic resistance genes in soil.
Cancer Research, 102:445-452 (2016)Cr(VI) reduction coupled with anaerobic oxidation of methane in a laboratory reactor.