サービスサポート

Q. サンプル発送から納品までの概要を教えてください。

A. ご依頼に際しまして、サンプルIDなどを記入して頂くサンプルシートをお送りするので、ご記入をお願いいたします。サンプルシートの電子版をメールで、印刷版をサンプルに同梱し代理店経由で弊社東京配送センターにお送りください。弊社ラボでQCを行い、結果をお知らせいたします。シーケンス後、結果はHDDもしくはクラウド経由でお届けいたします。

Q. サンプルの発送方法を教えてください。

A. サンプル要件、配送先住所、および出荷に関するアドバイスについては、お問い合わせください。

Q. DNAおよびRNAサンプルを送るにはどのような方法を使用できますか？

A. DNAサンプルの場合

１）室温で輸送する場合は凍結乾燥し、アイスパック/ブルーアイスで梱包します。 ⇒　サンプル到着後、弊社ラボで乾燥状態のDNAを溶媒で溶解します。サンプルシートにご希望の希釈体積をご指定お願いします。

２）推奨：クール便が可能な運送業者にて、十分なドライアイス（1日あたり5 kg）をサンプルに同梱します。 RNAサンプルの場合。

１）トータルRNAサンプル以外の場合、事前にご連絡ください

２）推奨：クール便が可能な運送業者にて、十分なドライアイス（1日あたり5 kg）をサンプルに同梱します。

３）抽出から承る場合、RNAlater®（組織サンプルの場合）またはRNAstable®（抽出したRNAサンプルの場合）を使用してRNAを安定化させ、室温でお送りください。

Q. サンプル発送の部材はどのような物を用いますか？

Q. サンプルQCに用いる方法を教えてください。

A. 弊社は、DNAサンプルに2つのQCを行っています。

①DNAの純度と分解程度計測のためのアガロースゲル電気泳動分析

②DNA定量のためのQubit®2.0蛍光光度計

Q. ゲノム断片の平均長を教えてください。

A. 各サンプルのゲノムDNAはランダムに断片化され、約350 bpの短い断片になります。

Q. より長い断片長のライブラリを調製することはできますか？

A. 可能です。最大800 bpのライブラリを正常に調製したこともございます。 ご希望の場合はあらかじめお問い合わせください。

Q.ヒト解析の推奨シーケンス深度を教えてください。

A. ヒト全ゲノム解析に推奨するシーケンスカバレッジの場合 SNPとIndelの検出については、少なくとも20倍のシーケンス深度を推奨してます。 SVおよびCNVの検出には、30倍のシーケンスカバレッジを推奨します。

Q.カスタム解析（既定サービスに無いご要望や個別注文）は可能ですか？

A. 可能です。 カスタム解析をご希望の場合は、お問い合わせください。

Q. データ解析にはどのような内容が含まれていますか?

A. シーケンスデータQC, シーケンスアラインメント、マッピング解析、SNP. InDel, SV, CNV解析を実施します。 しかし標準解析の内容は、生物種によって多少異なります。 ヒト：シーケンスデータQC, シーケンスアラインメント、マッピング解析、SNP. InDel, SV, CNV解析、ソマチック解析（腫瘍-正常ペアサンプル）

動植物：

パターン1：シーケンスデータQC, シーケンスアラインメント、マッピング解析、SNP. InDel解析

パターン2：シーケンスデータQC, シーケンスアラインメント、マッピング解析、SNP. InDel, SV, CNV解析

微生物：

シーケンスデータQC, シーケンスアラインメント、マッピング解析、SNP. InDel, SV解析

Q.データ解析依頼時に納品されるファイルを教えてください。

A. データ解析が含まれるご依頼の場合、弊社は解析レポートとともFASTQ、BAM、アノテーション、VCFファイルを解析レポートとともに納品いたします。納品ファイルは随時更新されるので、最新の納品ファイルについては営業担当者にお問い合わせください。

Q. gDNAサンプルの室温発送は可能ですか？

A. サンプルを室温で発送することはお勧めしません。 DNAはRNAよりも安定していますが、品質においては保存環境の影響を受ける可能性があります。 十分なドライアイス（1日あたり5kg）を詰め、クール便が可能な運送業者にてサンプルを発送してください。

Q. WGS解析の推奨シーケンス深度を教えてください。

a）Illuminaシーケンサーを使用したSNPおよびIndel検出では、少なくとも20倍のシーケンスカバレッジを推奨します。 Illuminaシーケンサーを使用したSVおよびCNV検出では、少なくとも30倍のシーケンスカバレッジをお勧めします。

b）PacBio Sequel IIまたはNanoporeシーケンサーを使用したSV検出には、少なくとも10倍のシーケンスカバレッジが必要です。 生物種にもよりますので、詳細はお問合せください。

Q. CRISPR/Cas9のOn-target, off-target解析はできますか。

A. 以下の情報があれば、解析は可能です。

①二倍体および染色体レベルの参照ゲノム。

②ケース/コントロールのペアサンプルのgRNA配列。

③標準解析の結果。 詳細については、お問い合わせください。

Q. Denovo アッセンブリーに役立つソリューションについて教えてください。

A. 弊社はIllumina のシーケンスの他に、PacBio Sequel II, Nanoporeなどのロングリードシーケンス、　10X Genomics Chromium を用いたLinked-Read、　Bionano Saphyr によるイメージングなど多数のソリューションを提供しております。これらの手法を組み合わせたアッセンブリ解析も提供しております。

Q. 多サンプルの場合の納期について教えてください。

A. サンプル数が多数になる場合通常よりも納期をいただく場合がございます。事前にお問い合わせください。

Q. エクソーム解析に用いているキットに関して教えてください。

A. Agilent 社SureSelect、Roche社 Kapa、Integrated DNA Technologies社キットを使用しております。

Q. 同一サンプル間のデータの相関性はどの程度ですか。

A.同一サンプル間の別調製サンプルの変異コールの相同性は約90%です。これはエクソームシーケンスの特性上変異コールの解析が通常のWGS（99%程度）に比べて困難なことに由来します 。

Q. RNA-Seq解析に用いることができるサンプルの条件を教えてください。

A. サンプル要件に関しては別紙記載の通りですが、RNA-Seqに関しては分解がなく、DNA、タンパク質のコンタミも少なく、十分な量が確保できていることが要件になります。微量サンプルにも対応できますのでご相談ください。これら条件を満たさない場合に全く解析が不可能という意味ではなく、解析が問題なく実施できた例は多数ございます。ただしデータの内容、出力に関して弊社としましては保証しかねます。

Q. サンプル量と品質を評価するためにNanoDropしか持っていないのですが、 ノボジーンのQCと比べてどうですか？

A. RNAのRIN値（分解指数）については、Bioanalyzer2100を使用してQCを行うことを推奨します。 多量の低品質サンプルよりも、少量の良質サンプルのほうがQC結果が良くなります。

DNA: 約1.8で純粋なDNAとして判定されます。

RNA: 約2.0で、純粋なRNAとして判定されます。

どちらの場合も比率が低い場合は、タンパク質、フェノール、または280 nmまたはその近くで強く吸収される他の汚染物質の存在を示している可能性があります。

* 260/230

この比率は、核酸純度の二次的指標として使用されます。

核酸純度指標の260/230指標は、一般的に260/280指標よりも数値が高くなります。

適正値は、通常2.0〜2.2の範囲です。比率がこれよりもはるかに低い場合は、230 nmで吸収される汚染物質を示している可能性があります。

260/230指標が適正値でなくても、QubitとBioAnalyzer 2100の数値が基準値であれば、ライブラリ調製とシーケンスに影響を与えることはほとんどありません。

Q. 昆虫RNAが分解されていないはずなのに、Bioanalyzer 2100でトータルRNAサンプルを検証すると、RIN値（分解指数）が低くなっているのはなぜですか？

A. ある生物種（昆虫および節足動物門）では、28S rRNAが変性条件下で切断され、18S rRNAと一緒に移動する「隠れた切れ目」を抱えています。つまり、RNAの純度決定にゲル電気泳動を用いているラボでも困惑した事態が生じます。

したがってトータルRNAの品質に関係なく、RIN値は常に低くなります。

Q. 真核生物Total RNAでもストランド特異的RNAライブラリ調製が可能ですか？

A. 可能です。ストランド特異的RNAライブラリはlncRNAや原核生物RNAに限らず実施可能です。

Q. サンプル量が少ないのですが、解析可能ですか？

A. ヒト、マウス、ラット、綿花、シロイヌナズナ以外は、リスクライブラリ(ライブラリ調製成功保証なし)で、対応可能です。詳細は、Homepageに記載されているサンプル要件をご確認ください。

A. 高スループットスケールでは、アライメントの精度を表します。 Q=−10log10(e)

Q. Qphred = -10log10(e) (シーケンスのエラー率)　 https://www.illumina.com/documents/products/technotes/technote_Q-Scores.pdf

A. ここで、eはベースコールが正しく行われない確率です。つまり、Q値が高いほどエラーの確率が低く、正しいベースコールが行われていることを意味しています。つまりQ20は、99％の精度、Q30は99.9%の精度ということです。一般的にIlluminaシーケンサーの場合、Q20≥90％、Q30≥80％のデータ品質は高いと考えられます。

Q. FPKM値が見たいのですが、どの解析を依頼すればいいですか？

A. 定量解析のメニューに含まれています。

Q. ノボジーンの提供するエピジェネティクス解析ソリューションを教えてください。

A. ChIP-seqやWhole Genome Bisulfite Sequenceの他に 、第三世代シーケンスを用いた塩基の直接読み取りなどを提供しております。

Q. 16S解析等はカスタムプライマーを用いることは可能ですか。

A. 可能です。 ただし、カスタムプライマーを含むサンプルはシーケンスのため、弊社にてプライマー配列を証後、カスタマイズされたソリューションをご提供いたします。

Q.サンプルQCは有償ですか？

A. ライブラリ調製を弊社で実施する場合は、2回目まで無償で行います。お客様がライブラリ調製したサンプルの場合は、初回から有償になります。

Q.シーケンス結果が希望データ量に届かなかった場合、追加シーケンスは有償ですか？

A.サンプルQCがPass判定の場合、無償で行います。HoldまたはFail判定の場合は、有償での対応となります。

Q. Small RNAのサンプルQCをお願いしても、全然通りません。

A. RNAがエクソソーム由来(microRNA)のサンプルとご指示ください。判定基準が変わります。

Q. 自分でもサンプルQCをするのですが、ノボジーンとの判定結果が違います。

A. 弊社サンプルQCは通常より判定基準が厳しいため、しばしば異なります。

Q, Fail判定の理由に「big insert fragments」とありますが、具体的な判定基準が知りたいです。

Q. PhiXライブラリとはなんですか？

A. PhiXは、PhiXウイルスから生成されたコントロールライブラリとして機能します。45％ATと55％GCベースで構成されています。

PhiXライブラリを追加すると、レーンシーケンスのライブラリの多様性が強化され、データ品質が向上します。

Q. シーケンス処理中にPhiXを添加する必要があるのはなぜですか？

A. ほとんどのライブラリでは、Illuminaは低濃度（1％）の添加済PhiX制御ライブラリを使用してクラスター生成、シーケンス、およびアラインメントのシーケンス品質管理を検証します。

WGBSライブラリなどのGC含量が不均衡なサンプルの場合、高濃度のPhiXを添加して、クロストークと位相計算を改善します。 例えば多様性の低いサンプルの場合は、高濃度（5％以上）のPhiXを添加して、より多様なクラスターのセットを作成します。

ライブラリごとに適した条件がございます。添加の必要な場合はお客様お使いのキットに記載のある条件をご提示ください。

Phixを必要とするライブラリタイプのリストについては、以下を参照してください。

ライブラリタイプ特性

制限部位関連DNAシーケンス（RAD）

ライブラリ低多様性

シーケンス（GBS）

ライブラリによるジェノタイピング低多様性

10×単一細胞RNAライブラリ低多様性

単一細胞DNA / RNAライブラリ低多様性

アンプリコンライブラリの低多様性 微生物再配列ライブラリの不均衡

全ゲノム重亜硫酸塩シーケンス（WGBS）ライブラリアンバランス

Q. マルチプレックスとはどういう意味ですか？メリットは何ですか？

A. readにインデックスを添加し、それを一つのサンプルに混ぜる(プーリングする)ことです。ライブラリQCを行い、demultiplexedと連絡がきた時は、ご提供のインデックス配列が実際と異なり、データ分離が行えない状況を指しています。

Q.UDI（Unique Dual Index）を使って調製したのですが、ノボジーンでも対応していますか。

A. Illumina対応キットであれば問題ありません。※TruSeqキット使用の場合、相乗りシーケンス だと他のサンプルの影響を受け、データ量が下がってしまう恐れがあります。レーンシーケンスの場合は問題ありません。

Q.マルチプレックスの場合、最大プレックス数はいくつですか？

A. 特に指定はありません。事前にご相談いただければ、1レーン当たり96、384プレックスでも可能です。

Q. 同じサンプルにプーリングしてるいるのに、サンプル間でデータ量が大きく違うのは何故ですか。

A. プーリングしている場合、均一なデータ量は取得できません。多少の差は仕方ありませんが、差が1/10など大きく違う場合は、ご提供のインデックス配列が間違っている可能性もあります。

Q.異なるインサートサイズのDNAサンプルを異なるシーケンス方法で読めますか？

A. 同時には読めないので、シーケンス方法毎に適したDNAサンプルのご提供をお願いします。

Q. 自作アダプター、プライマーを用いたシーケンスは可能ですか。

A. 実施可能かどうかはご確認ください。実施の際にはシーケンス設定の変更を含むこともありえますので、lane単位、Flowcell 単位でご注文いただく可能性がございます。

Q. カスタムread1プライマーを使用して1レーンシーケンスを注文できますか？

A. カスタムシーケンスプライマーを使用したNovaSeq S4プロジェクトの場合、フローセル全体を注文する必要があります。 プライマーの配列、運送・保存方法（凍結乾燥など）、ナノモル単位の量、必要な希望濃度で追加するバッファーの量を教えてください。

Q.提供しているシーケンスメソッドを教えてください。

A. ① PE150 on NovaSeq platform. ② PE250 on NovaSeq SP platform ③ SE50/PE50 on NovaSeq SP platform.

Q. 一つのサンプルに対し、データファイルが二つあるのですが、どう違うのですか？

A. ペアエンド方式(PE150、PE250等)で読んだ場合、両端から読んだデータ毎(read1、read2)にファイルが存在します。

Q. ライブラリ調製に、どのキットを用いていますか?

A.主に用いているキットは以下になります。詳細は、お問い合わせください。

DNA library prep kit: NEB Next® Ultra™ DNA Library Prep Kit

RNA library prep kit: NEB Next® Ultra™ RNA Library Prep Kit

PCR-free DNA library prep kit: NEB Next® Ultra™ DNA Library Prep Kit

Q.解析終了後残ったサンプルを返送することはできますか?

A. 申し訳ありませんが、返送は承っておりません。

Q. シーケンス終了後ライブラリを返送していただくことは可能ですか?

A. ライブラリをノボジーンで調製した場合、そのサンプルを返送することは致しかねます。

Q. ノボジーンのシーケンス結果情報に関するデータの取り扱いに関して教えてください

A. 弊社では、お客様のデータと知的財産の機密性とセキュリティを最優先としています。 確立した民間企業として、お客様のデータの整合性を維持することは、弊社のビジネスにとって重要です。

現在までに相当数の実績がございます。

弊社のプライバシーポリシーに従い、お客様のデータはお客様の許可なく他の当事者または組織に開示されることはありません。

またお客様のデータ納品後、指定期間後には弊社のデータベースから削除されます。 要請があれば、機密保持の条件を明確に定義した合意書を提供いたします。