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サービス

16S/18S/ITS アンプリコンメタゲノムシーケンス

概要

16S/18S/ITS アンプリコンメタゲノムシーケンスは、特定の領域（アンプリコン）をターゲットとして詳細な解析を行うDNAシーケンス手法です。このアプローチでは、PCRを用いて保存遺伝子または遺伝子間領域の短い（<500 bp）超可変領域を増幅し、次世代シーケンス（NGS）を行います。この手法により、複雑なサンプル内の複数の微生物種の同定と区別が可能になります。アンプリコンメタゲノムシーケンスは、細菌および古細菌の16SリボソームRNA（rRNA）遺伝子、真核生物の18S rRNA遺伝子、および真菌（酵母、カビ、およびその他の関連種を含む）の内部転写スペーサー（ITS）領域を特異的にターゲットとしています。これにより、包括的な系統学的および分類学的分析が可能になります。

ノボジーンのアンプリコンメタゲノムシーケンスサービスは、ショットガンメタゲノムシーケンスと比較してコスト効率の高いアプローチで標的生物をスクリーニングし、複雑な微生物群集の多様性に関する知見を提供します。このアプローチは、微生物生態学研究、特定の微生物群の系統解析、純粋培養における種の同定、病原性か有益性かにかかわらず関心のある生物の検出などに広く利用されています。

16S/18S/ITS アンプリコンメタゲノムシーケンスはどのように機能するのか？

アンプリコンメタゲノムシーケンスは、多様なサンプル中の微生物の全スペクトルを探索するための強力な手法です。この手法は特に次のような場合に有効です：

  • 複雑な微生物集団の中から目的の特定の生物をターゲットとし、同定する。
  • 微生物群集の包括的な側面を提供するために、多種多様な微生物に注釈を付け、分類する。
  • 正確な分類学的解析のために、細菌や古細菌（16S）と、真菌や原生生物（ITS/18S）のような他の真核生物を区別する。
  • 病原体、微生物汚染、有益な土壌細菌、その他の関連微生物の検出。
  • 生理的流体や組織サンプルを分析し、疾患や癌の診断に役立てる。

このアプローチは、微生物の多様性に関する詳細な洞察を提供し、様々な研究や診断アプリケーションにおける貴重なツールとなります。

利点

 

ノボジーンは、アンプリコンシーケンスプロジェクトにおける豊富な経験を活かし、近年、アンプリコンメタゲノムシーケンス用のショートリードおよびロングリード（16S Full-Length Amplicon Sequencing）技術を含む最先端のパイプラインを開発しました。

 

また、Qiime1パイプラインによるOTU（Operational Taxonomic Units）へのクラスタリングや、Qiime2パイプラインのDADA2によるASV（Amplicon Sequence Variants）へのノイズ除去など、ノボジーンのサービスは、実験デザインにおいて比類のない柔軟性を提供します。さらに、Qiime 1パイプラインとQiime 2パイプラインの両方を通じて、カスタマイズされた解析とデータベースを備えたテーラーメイドのソリューションを提供し、特定の研究要件との正確な適合を保証します。

アンプリコンメタゲノムシーケンスに用いられるプライマー

 

タイプ 増幅領域 フラグメント長 プライマー 配列(5’-3’)
細菌16S V4 300 bp 515F GTGCCAGCMGCCGCGGTAA
806R GGACTACHVGGGTWTCTAAT
V3-V4 470 bp 341F CCTAYGGGRBGCASCAG
806R GGACTACNNGGGTATCTAAT
V4-V5 450 bp 515F GTGCCAGCMGCCGCGGTAA
907R CCGTCAATTCCTTTGAGTTT
V5-V7 (for endophytic) 435 bp 799F AACMGGATTAGATACCCKG
1193R ACGTCATCCCCACCTTCC
古細菌 V4
(AKA 新規古細菌　V4)		 V4-V5 415 bp Arch519F GTGCCAGCMGCCGCGGTAA
Arch915R GTGCTCCCCCGCCAATTCCT

 

タイプ 増幅領域 フラグメント長 プライマー 配列(5’-3’)
糸状菌 18S V4 350 bp 528F GCGGTAATTCCAGCTCCAA
706R AATCCRAGAATTTCACCTCT
糸状菌 ITS ITS1 200-400 bp ITS5-1737F GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG
ITS2-2043R GCTGCGTTCTTCATCGATGC
ITS2 380 bp ITS3-2024F GCATCGATGAAGAACGCAGC
ITS4-2409R TCCTCCGCTTATTGATATGC
ITS1-1F (for endophytic) 200-400 bp ITS1-1F-F CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA
ITS1-1F-R GCTGCGTTCTTCATCGATGC

 

仕様：DNAサンプル要件

サンプルタイプ サンプル量 液量 濃度 純度
total DNA ≥ 200 ng ≥ 20 μL ≥ 10 ng/μL
OD260/280 = 1.8-2.0
分解なし, 色なし, コンタミなし

仕様：シーケンスと解析

シーケンス
プラットフォーム		 イルミナNovaSeq 6000
シーケンス法 NovaSeq 試薬 (500サイクル)
Data Output 50K/100K/500K raw tags
Qiime1/Qiime2 標準解析
  • データQC
  • OUT/ASV/クラスタリング
  • 分類学的アノテーション
  • αおよびβ多様性解析 (UPGMA, PCA, PCoA, NMDS)
  • 集団差解析 (Anosim, MRPP, Simper)
  • 統計解析 (T検定, MetaStat, LEfSe)
  • 機能予測 (Qiime2のみ）
高次解析
  • スピアマン, CCA/RDA, VPA解析
  • ネットワーク解析
  • 機能予測解析

プロジェクトワークフロー

ノボジーンは、プロジェクトのワークフロー全体を通じて、高品質の製品と専門的なサービスを提供します。各ステップは厳格な科学的基準を満たすように慎重に設計・実行され、卓越した研究成果を保証します。シーケンスデータの正確性と信頼性を保証するため、プロセスの各段階で厳格な品質管理（QC）対策が実施されます。ワークフローには、サンプル調製と定量、フラグメンテーションとライブラリー調製、ライブラリー品質管理、シーケンス、バイオインフォマティクス解析などの主要ステップが含まれます。

アンプリコンメタゲノムシーケンスを用いた論文

アンプリコンメタゲノムシーケンスは、OTUまたはASVを使用して微生物種の同定および分化を目指す研究者にとって強力なツールです。16S/18S/ITS rRNAシーケンス結果を用いて、アルファ（α）およびベータ（β）多様性解析による環境の微生物多様性を特徴付け、目的の微生物を同定、記述、追跡することができます。Novogene Amplicon Metagenomic Sequencingサービスを使用した主な論文のリストです。

Novogene's Qiime2 Analysis Pipeline

Function prediction is included in Qiime2’s standard analysis pipeline.

The evolutionary tree in genus

Different colors of the branches represent different phyla. Relative abundance of each genus in each group was displayed outside the circle and different colors represent different groups.

Alpha Diversity- Rarefaction Curves

In the Rarefaction curves, each curve represents a sample, and can be colored and shaped by each sample name supplied in the mapping file. The sequence number is on the X-axis and the observed OTUs number is on the Y-axis.

Network Analysis

The node represents the genus, the node size represents the average relative abundance of the genus, the node color of the same phylum is same, the thickness of the line between nodes is positively correlated with the absolute value of the correlation coefficient of the species interaction, and the line color is positively correlated with the positive and negative correlation respectively (red represents positive correlation, blue represents negative correlation).

Spearman Correlation Test

Rows: environmental factors; Columns: species; Colored tiles corresponding the coefficient of Spearman rank correlation r value, whose range is from -1 to 1. r<0 negative correlation; r>0 positive correlation; ＊ means significant (p<0.05).

その他の解析サービス

ショットガンメタゲノムシーケンス

シャローショットガンメタゲノミクス