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RNAシーケンス（RNA-seq）

RNAシーケンス（RNA-seq）

RNAシーケンス（RNA-seq）は、細胞機能の研究に変革をもたらし、研究者に細胞の転写ランドスケープに対する前例のない洞察を提供しています。ハイスループットで正確な次世代シーケンサー技術（NGS）を採用することで、RNA-seqは遺伝子発現 プロファイルを明らかにし、トランスクリプトームの連続的な変化を説明することができます。RNA-seq技術では、一本鎖のメッセンジャーRNA（mRNA） を選択的にキャプチャーまたは濃縮し、ライブラリー調製のために相補的DNA（cDNA）(mRNAs) に変換します。

ノボジーンでは、ペアエンド150bpシーケンス戦略（ショートリード）を利用する最先端のイルミナNovaSeqプラットフォームを使ってcDNAライブラリをシーケンスします。豊富な経験と強力なシーケンス能力とともに、ノボジーンは様々な研究目的に対応するサービスを提供しています。真核生物のmRNAシーケンス（mRNA-seq）サービスだけでなく、原核生物の転写産物、ノンコーディングRNA、完全長アイソフォーム（ロングリード）、全トランスクリプトーム、メタトランスクリプトームに関するデータも提供することが可能です。

RNAシーケンスのアプリケーション

mRNA-seqは、細胞のトランスクリプトームプロファイルを解析するための強力なツールです。ノボジーンのプロフェッショナルサービスは、以下のような幅広いアプリケーションで研究目標をサポートします：

  • 様々な条件や処理のもとでの異なる組織やサンプルの転写物の定量的プロファイリング
  • 新規転写物、選択的スプライシング（AS）、 転写物の変異の発見
  • 組織特異的な転写物や時間経過に伴う遺伝子発現を利用した発生メカニズムや薬剤耐性に関する研究
  • 新規転写産物/アイソフォーム、SNP/InDel同定、融合遺伝子解析に基づくバイオマーカー探索
  • トランスクリプトームと組み合わせたオミックス解析
  • 臨床診断における発症メカニズムやクリニカルサブタイプの検討

ノボジーンRNAシーケンスの利点

  • ノボジーンのmRNA-seqは、ハイスループットと高い精度 （Q30スコア≥85%）)を提供し、必要な初期RNA投入量も少なくて済みます。RNA-Seqサービスを提供する豊富な経験を有し、何千ものプロジェクトを成功させ、多くの研究者がインパクトファクターの高いジャーナルで発表することを支援しています。
  • ノボジーンは、定量化、 遺伝子発現の差異、 新規転写物のアノテーション、 代替スプライシング、 融合遺伝子の発見、その他の潜在的な変化に対する包括的なソリューションを提供します。高度な資格を持つバイオインフォマティシャンが、参照ゲノムがある種、ない種を問わず、パーソナライズされたパイプラインを使用して、論文投稿可能なデータを提供します。

RNA-seq仕様：サンプル要件

Library Type Sample Type Amount RNA Integrity Number (Agilent 2100) Purity (NanoDrop)
Eukaryotic RNA-Seq (cDNA library) Total RNA ≥ 200 ng ≥ 4.0, with smooth base line A260/280 = 1.8-2.2
A260/230 ≥ 1.8
Total RNA (Blood) ≥ 400 ng ≥ 5.8, with smooth base line
Amplified cDNA (double-stranded) ≥ 100 ng Fragments between 400bp and 5000bp with main peak at ~2000bp A260/280 = 1.8-2.0
A260/230 ≥ 1.8
Eukaryotic RNA-Seq (strand specific library) Total RNA ≥ 400 ng ≥ 5.8, with smooth base line A260/280 = 1.8-2.2
A260/230 ≥ 1.8

注：サンプル量は参考として記載しています。詳しくは、「 サービス仕様書」または「サンプル要件 」をダウンロードしてご確認ください。詳細な情報については、「カスタマイズされたリクエストについて」とご連絡ください。

RNA-seq仕様：シーケンスと解析

Sequencing Platform Illumina NovaSeq 6000 Sequencing System
Read Length Paired-end 150 bp
Data Output
  • ≥ 20 million read pairs per sample for species with reference genome
  • ≥ 50 million read pairs per sample for species without reference genome (de novo transcriptome assembly projects)
Data Analysis Capability
  • Data Quality Control
  • Gene expression quantification
  • Differential expression profiling
  • Functional enrichment analysis
  • Novel transcripts identification
  • SNP & InDel analysis
  • Alternative splicing (AS) analysis
  • Fusion gene prediction
  • Protein-Protein Interaction (PPI) analysis
  • Transcription factors and oncogene functional annotation

注：表示される推奨データ出力や解析内容は、あくまで参考です。詳しくは、 サービス仕様書 をダウンロードしてください。詳細な情報については、「カスタマイズされたリクエストについて 」とご連絡ください。

RNA-seqサービスのプロジェクトワークフロー

プロジェクトのワークフローは、お客様のサンプルがRNA-Seqの基準を満たすことを確認するためのサンプル品質管理（Sample QC）から始まります。それから、ターゲットとなる生物とアプリケーションに応じて適切なライブラリを作製し、その品質をテストします（ (ライブラリQC）。次に、150bpのペアエンド シーケンスを用いてサンプルのシーケンスを行い、得られたデータの品質もチェックします（Data QC）。最後に、バイオインフォマティクス解析を行い、論文掲載可能な結果をご提供いたします。以下のフローシートは、mRNA-seq技術フローの段階的なプロトコルを説明したものです。

サンプルの調製に続き、RNAライブラリの調製を行います。RNAライブラリーは、polyAキャプチャー（またはrRNA除去法）およびcDNAの逆転写によって形成されます。イルミナPE150テクノロジーでサンプルのシーケンスを行い、最終段階でバイオインフォマティクス解析を行います。


FAQS

RNA-seqで得られるデータ量は研究目的によって異なります。

  • 低発現遺伝子の検出での発現変動解析の場合、発現レベルに応じて3,000万～6,000万リードで深くシーケンスすることをお勧めします。十分な繰り返しサンプル数を3,000万リードから始めてください。
  • 一般的な遺伝子レベルの発現変動解析を実施する場合、ENCODEガイドラインではサンプルあたり3,000万リードが推奨されています。（ストランド特異的シーケンスの場合）しかし、十分な繰り返しサンプル数（>3）があれば、サンプルあたり2,000万リードで十分な場合が多いです。

RNA-seq実験では、biological replicateを6サンプル使用することをお勧めします。詳細は、以下の論文をご参照ください。

Schurch NJ, Schofield P, Gierliński M, Cole C, Sherstnev A, Singh V, Wrobel N, Gharbi K, Simpson GG, Owen-Hughes T, Blaxter M, Barton GJ. How many biological replicates are needed in an RNA-seq experiment and which differential expression tool should you use? RNA. 2016 Jun; 22(6):839-51. doi: 10.1261/rna.053959.115. Epub 2016 Mar 28. Erratum in: RNA. 2016 Oct; 22(10):1641. doi: 10.1261/rna.058339.116. PMID: 27022035; PMCID: PMC4878611.

ストランド非特異的 RNA-seq は、転写物の向きを保持せずにライブラリを調製するため、リードがセンス鎖由来かアンチセンス鎖由来かを区別することができません。一方、ストランド特異的 RNA-seq はこの向きを保持するため、転写物をそのゲノム上の由来鎖に正確にマッピングすることが可能です。

次のような場合には、ストランド特異的 RNA-seq の使用を推奨します：

  • 反対方向の鎖上に重なって存在する遺伝子を分離し、正確に転写物を定量する必要がある場合。
  • アンチセンス転写物や長鎖ノンコーディング RNAなどのノンコーディング RNA を特定・解析する場合。
  • 転写開始点・終了点やエクソン–イントロン境界を正確にマッピングし、遺伝子アノテーションを改善する場合。
  • 複雑な真核生物における遺伝子制御の理解や、原核生物におけるオペロン構造のマッピングを行う場合。

ストランド情報を保持することで、ストランド特異的 RNA-seq は転写物定量や遺伝子アノテーションの信頼性を高められるため、高解像度のトランスクリプトーム解析が求められる研究において推奨される選択肢となります。

RNAサンプルを提出される前に、必ず当社の技術担当者に実験デザインについてご相談ください。

サンプル輸送時の保管方法、輸送方法などについての資料をご用意しております。また、サンプル発送の前に提出して頂くサンプルシートをご用意しております。

サンプルを発送する前にサンプルシートと、発送方法をまとめた資料をお送りいたします。お問い合わせください。

主な違いは、遺伝子発現プロファイリングの解像度と、各手法が提供する生物学的知見の種類にあります。

シングルセルRNAシーケンス（scRNA-seq）は、シングルセル解像度での全トランスクリプトームプロファイリングを可能にし、細胞間の変異の解明、希少細胞の検出、そして動態の研究を可能にします。この高解像度アプローチは、腫瘍微小環境、発達中の組織、複雑な免疫応答といった異種サンプルの解析に特に有用です。

ノボジーンのRNA-seqサービスを利用した注目の論文

RNA-seq（mRNA-seq）は、最も頻繁に引用されるNGSメソッドです。ここでは、ノボジンのRNAシーケンス（mRNAシーケンス）サービスを利用した優れた学術論文をまとめています。

Error Rate Distribution

error rate for Novogene RNA-seq

The x-axis shows the base position along each sequencing read and the y-axis shows the base error rate.

GC Content Distribution

GC Content Distribution for Novogene RNA-seq

The x-axis for reads position, the y-axis for single base percentage. Different color for different base type.

Classification of Raw Reads

Classification of Raw Reads for Novogene RNA-seq

Reads Distribution on Reference Genome

Reads Distribution on Reference Genome for Novogene RNA-seq

Gene Expression Quantification

Gene Expression Quantification for Novogene RNA-seq

The x-axis represents the name of sample, the y-axis indicates the log10(FPKM+1), parameters of box plots are indicated, including maximum, upper quartile, mid-value, lower quartile and minimum.

Volcano Plot of changes on Gene Expression

Volcano Plot of changes in Gene Expression for Novogene RNA-seq

The x-axis shows the fold change of genes in different samples. The y-axis shows the statistically significant degree of changes in gene expression levels. The smaller the corrected pvalue, the bigger -log10(corrected pvalue), the more significant the difference. The points represent genes, blue dots indicate no significant difference in gene expression, red dots indicate upregulated differentially expressed genes, green dots indicate downregulated differentially expressed genes.

Hierarchical Clustering Heatmap of Differential Expression

Hierarchical Clustering Heatmap of Differential Expression for Novogene RNA-seq

The overall results of FPKM cluster analysis, clustered using the log10(FPKM+1) value. Red denotes genes with high expression levels, and blue denotes genes with low expression levels. The color ranging from red to blue indicates log10(FPKM+1) value from large to small.

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